domingo, 4 de diciembre de 2011

Curva de crecimiento






La curva del crecimiento bacteriano resulta de la representación gráfica de la determinación periódica del número de células viables por mililitro que existen en un líquido inoculado con células microbianas provenientes de un cultivo que ha crecido previamente hasta la saturación.

  Fase de Rezago.
Este periodo consiste en la adaptación de las células microbianas a su nuevo ambiente. En esta fase, las células microbianas se envuentran empobrecidas en cuanto a metabolitos y enzimas, esto debido a las condiciones desfavorables que representaba el cultivo previo.
Por lo anterior, en este lapso de tiempo se forman las enzimas y los metabolitos intermedios hasta alcanzar las concentraciones necesarias para reiniciar el crecimiento.
Este periodo se puede prolongar en el caso de que el medio de cultivo previo y las condiciones actuales resulten tan diferentes que las células sean genéticamente incapaces de sobrevivir, por lo que sólo unas cuantas mutantes podrán subsistir, y obviamente se requerirá más tiempo para que éstas se multipliquen lo suficiente y sea notorio el aumento de células.
 Fase Exponencial.
Como el nombre lo indica, en esta fase las células se encuentran en un estado de crecimiento sostenido.
Se sintetiza nuevo material celular a una tasa constante, pero éste material es en sí catalítico y la masa aumenta de manera exponencial. Lo anterior continua hasta que uno o más nutrimentos se agoten, o hasta que se acumule tal cantidad de metabolitos tóxicos que se inhiba el crecimiento. El nutrimento limitante para los organismos aerobios suele ser el oxígeno : cuando la concentración bacteriana es de aproximadamente 1 x 107 / ml es necesario incrementar el ingreso de oxígeno mediante agitación o burbujeo ; pero cuando la concentración alcanza 4 o 5 x 109 bacterias por ml, la tasa de difusión de oxígeno no puede satisfacer las demandas aun en un medio aireado, por lo que el crecimiento disminuye progresivamente.
Durante el crecimiento exponencial, la tasa de crecimiento de las células (medida en gramos de biomasa producida por hora), cuando el crecimiento no es limitado por los nutrimentos, se puede obtener multiplicando la constante de la tasa de crecimiento (k) por la concentración de biomasa. La constante de la tasa de crecimiento es la tasa a la cuál las células producen más células, y el valor que esta toma se interpreta como los gramos de biomasa producidos por cada gramo de biomasa preexistente creados en una hora.
El crecimiento se denomina exponencial porque la biomasa se incrementa exponencialmente con respecto al tiempo. De lo anterior se deriva que, si graficamos el logaritmo de la concentración de la biomasa (o celular) en función del tiempo, como ocurre en la curva del crecimiento, obtendremos una línea recta como representación de esta fase.
Esta fase puede prolongarse indefinidamente si las células se transfieren repetidamente a un medio nuevo (fresco) de composición idéntica al anterior, lo cual se logra de manera automática mediante dos aparatos : el quimiostato y el turbidostato.
Fase Estacionaria Máxima.
Como se explicó en la descripción de la fase anterior, ante el agotamiento de nutrimentos en el medio o la acumulación de metabolitos tóxicos el crecimiento cesa por completo después de un periodo de decrecimiento en la tasa de crecimiento, lo cual corresponde a la fase D o de retraso.
No obstante, por lo general en esta fase se puede observar recambio celular, lo cual se debe a que, aunque existe una pérdida lenta de células por muerte, dicha pérdida se compensa exactamente por la formación de nuevas células a través de crecimiento y divisón. Así, la cifra de células viables se mantiene constante, aunque en realidad en el conteo aumente poco a poco el número de células, si se cuentan también las muertas.
Para comprender lo anterior debemos considerar que, para una célula microbiana, muerte significa la pérdida irreversible de la capacidad para reproducirse (crecer y dividirse), lo cuál se comprueba cuando una célula es incapaz de producir una colonia en cualquier medio. De lo anterior se deriva que designar a una célula microbiana como muerta no implica su destrucción física.
La duración de esta fase depende de la naturaleza del microorganismo y de las condiciones del medio.
Fase de Declinación.
Esta fase, también conocida como fase de muerte, representa el decremento de células debido al aumento progresivo de la tasa de mortalidad, misma que tarde o temprano alcanza un valor sostenido.
Por lo general, una vez que la mayoría de las células ha muerto, la tasa de mortalidad disminuye bruscamente, por lo que un número pequeño de sobrevivientes pueden persistir en cultivo por meses o años. Dicha persistencia puede deberse a que las células consiguen crecer gracias a los nutrimientos liberados por las células que mueren y se lisan, observándose recambio celular.

Principios de bioseguridad en microbiologia

  1. Sin importar se se conoce o no la serologia del paciente, se deben tomar precauciones y normas de bioseguridad: todo individuo debe ser tratado como si tuviera sida o hepatitis B.
  2. Barreras de seguridad: Barreras primarias son las localizadas en torno al origen de riesgo.Barreras secundarias localizadas en el circulo del operador. Barreras terciarias son las que se encuentran al rededor del laboratorio.
  3. Clasificación de los microorganismos según el grupo de riesgo (1,2,3,4).



Procedimientos de las tinciones gram y neelsen




Tincion de ziehl neelsen

La tinción de Ziehl-Neelsen (BAAR) es una técnica de tinción diferencial rápida y económica, para la identificación de microorganismos patógenos ácido alcohol resistentes, por ejemplo M. tuberculosis.
Fue descrita por primera vez por dos médicos alemanes, Franz Ziehl, un bacteriólogo y Friedrich Neelsen, un patólogo.
Las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloracíón con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-alcohol resistentes. Las micobacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los parásitos coccídeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia. La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al suspender el calentamiento y enfriar con agua, provoca una nueva solidificación de lo ácidos grasos de modo que el colorante ya no puede salir de las bacterias. Por otro lado, el calentamiento aumenta la energía cinética de las moléculas del colorante lo cual también facilita su entrada a las bacterias. Las bacterias que resisten la decoloración son de color rojo y la que no se ven de color azul, ya que se utiliza azul de metileno como tinción de contraste.

Tincion de gram

La tinción de Gram es usada para clasificar bacterias sobre la base de sus formas, tamaños, morfologías celulares y reacción Gram (color). A nivel del laboratorio es útil como test para un rápido diagnóstico presuntivo de agentes infecciosos, tanto en muestras como en cultivos en crecimiento, y adicionalmente sirve para valorar la calidad de la muestra clínica. Las bacterias se tiñen gram positivas (+), gram negativas (–) o no se tiñen debido a sus diferencias en la composición de su pared y arquitectura celular.
     Las bacterias gram (+) tienen una gruesa capa de péptidoglucano y gran cantidad de ácidos teicóicos que no son afectados por la decoloración con alcohol y/o acetona, reteniendo el colorante inicial acomplejado con iodo y visualizándose en distintos grados de tonos desde el violeta al azul claro, dependiendo de si la naturaleza de su pared celular está intacta o dañada (por tratamientos antibióticos, edad celular…).
 Las bacterias gram (–) tienen en su pared celular una delgada capa de peptidoglucano ligada a una membrana externa por moléculas de lipopolisacáridos. Esta membrana externa es dañada por el alcohol y/o acetona de la decoloración, permitiendo que el primer colorante acomplejado con iodo escape y sea reemplazado por el contracolorante. Clásicamente los reactivos utilizados para la realización de la tinción de Gram han sido el cristal violeta como colorante inicial, la solución de lugol para acomplejar a éste, el alcohol y/o acetona para la decoloración y la safranina o fucsina básica como contracolorante.
     Existen una serie de puntos con respecto a un buen control de calidad de las tinciones de Gram, y que deben ser tenidas en cuenta antes de su realización, a saber
   · Diariamente se debe comprobar que no existen precipitados ni cristales en la solución de cristal violeta. Si los hay, filtrar antes de su uso.
          · La estabilidad de la solución de cristal violeta, alcohol y/o acetona, safranina o fucsina básica es de 1 año y la de la solución de lugol de 6 meses, todas ellas conservadas en frascos cerrados (la evaporación puede alterar su efectividad) a temperatura ambiente.
          · Cada nuevo lote, aunque lo recomendable sería diariamente, preparar tinciones con cepas de colección de E.coliS.aureus o S.epidermidis  para comprobar los resultados esperados.
   · Ciertos procedimientos de laboratorio pueden dificultar la interpretación microscópica de la tinción, como son la preparación de extensiones demasiado gruesas, uso de portas que no han sido prelavados o desengrasados, sobrecalentamiento en la fijación y excesivos lavados durante la tinción. Todos los anteriores son causas comunes de pobres resultados en la tinción de Gram.
· Debe tenerse en cuenta que no todos los microorganismos observados en una tinción pueden ser cultivados, y al contrario, algunos no observados pero presentes consiguen ser recuperados en el cultivo.


Ramas de la microbiologia

El campo de la microbiología puede ser dividido en varias subdisciplinas:

  • Fisiología microbiana: estudio a nivel bioquímico del funcionamiento de las células microbianas. Incluye el estudio del crecimiento, el metabolismo y la estructura microbianas.
  • Genética microbiana: estudio de la organización y regulación de los genes microbianos y como éstos afectan el funcionamiento de las células. Está muy relacionada con la biología molecular.
  • Microbiología clínica: estudia la morfología de los microbios.
  • Microbiología médica: estudio del papel de los microbios en las enfermedades humanas. Incluye el estudio de la patogénesis microbiana y la epidemiología y está relacionada con el estudio de la patología de la enfermedad y con la inmunología.
  • Microbiología veterinaria: estudio del papel de los microbios en la medicina veterinaria.
  • Microbiología ambiental: estudio de la función y diversidad de los microbios en sus entornos naturales. Incluye la ecología microbiana, la geomicrobiología, la diversidad microbiana y la biorremediación.
  • Microbiología evolutiva: estudio de la evolución de los microbios. Incluye la sistemática y la taxonomía bacterianas.
  • Microbiología industrial: estudia la explotación de los microbios para uso en procesos industriales. Ejemplos son la fermentación industrial y el tratamiento de aguas residuales. Muy cercana a la industria de la biotecnología.
  • Aeromicrobiología: estudio de los microorganismos transportados por el aire.
  • Microbiología de los alimentos: estudio de los microorganismos que estropean los alimentos.
  • Microbiología espacial: Estudio de los microorganismos presentes en el espacio extraterrestre, en las estaciones espaciales, en las naves espaciales.


Factores ambientales que afectan el crecimiento microbiano

TEMPERATURA..
- Según su comportamiento frente a la temperatura, los organismos pueden ser térmofilos, mesófilos y psicrofilos.
ACTIVIDAD DE AGUA REDUCIDA.
- Los microorganismos requieren la presencia de agua, en una forma disponibles, para que puedan crecer y llevar a cabo sus funciones metabólicas. La mejor forma de medir la disponibilidad de agua es mediante la actividad de agua (aw). La aw de un alimento puede reducirse aumentando la concentración de solutos en la fase acuosa de los alimentos mediante la extracción del agua o mediante la adición de solutos.
- La deshidratación es un método de conservación de los alimentos basado en la reducción de la aw, durante el curado y el salazonado, así como en el almíbar y otros alimentos azucarado son los solutos los que, al ser añadidos, descienden la aw.
-Un pequeño descenso de la aw es, a menudo, suficiente para evitar la alteración del alimento, siempre que esta reducción vaya acompañada por otros factores antimicrobianos.
- La mayoría de las bacterias y hongos crece bien a aw entre 0,98 y 0,995; a valores aw más bajos la velocidad de crecimiento y la masa celular disminuyen a la vez que la duración de la fase de latencia aumenta hasta llegar al infinito (cesa el crecimiento).
- Algunos tipos de microorganismos son capaces de crecer en condiciones de alto contenido de sal (Baja aw). Dependiendo de la capacidad de supervivencia a baja aw se denominan osmófilos, xerófilos y halófilos (según va aumentando su requerimiento de sal).
- La baja aw reduce también la tasa de mortalidad de las bacterias: una baja aw protege los microorganismos durante tratamientos térmicos.
pH Y LA ACIDEZ.
- En general, la presencia de ácidos en el alimento produce una drástica reducción de la supervivencia de los microorganismos. Los ácidos fuertes (inorgánicos) producen una rápida bajada del pH externo, aunque su presencia en la mayoría de los alimentos es inaceptable. Los ácidos orgánicos débiles son más efectivos que los inorgánicos en la aciclificación del medio intracelular; se supone que esto ocurre porque es más fácil su difusión a través de la membrana celular en su forma no disorciada (lipofílica) y posteriormente se disocian en el interior de la célula inhibiendo el transporte celular y la actividad enzimática.
- La mayoría de los microorganismos crecen a pH entre 5 y 8, en general de hongos y las levaduras son capaces de crecer a pH más bajos que las bacterias. Puesto que la acidificación del interior celular conduce a la pérdida del transporte de nutrientes, los microorganismos no pueden generar más energía de mantenimiento y, a una velocidad variable según las especies, se produce la muerte celular.
GASES COMO CONSERVADORES.
- Diversos gases y vapores naturales o artificiales destruyen o inhiben los microorganismos. El nitrógeno y el oxígeno se usan con frecuencia en el envasado y almacenamiento de los alimentos pero su fin primario no es la inhibición de los microorganismos; diversos gases son poderosos biocidas y se han utilizado con éxito en la desinfección de hospitales, establos y compartimentos de barcos o como fumigantes del suelo, pero no se han aplicado a los alimentos.
- El CO2 inhibe el crecimiento de microorganismos sobre los alimentos con eficiencia creciente cuanto más desciende la temperatura. Este efecto se manifiesta tanto en bacterias como en hongos por un incremento de la fase de latencia y del tiempo de generación durante la fase logarítmica. Su mecanismos de inhibición no se conoce con claridad, aunque se debe a la presencia del CO2 (y quizá a la formación de ácido carbónico) y no a la ausencia de oxígeno. Los mohos y las levaduras son alga más resistentes al CO2 que las bacterias (las Gram-negativas más sensibles que las Gram-positivas).
- La actividad antimicrobiana del dióxido de azufre está relacionada con la forma molecular no ionizadas: no se conoce un modo de acción, aunque este gas es muy reactivo y probablemente interacciona con muchos componente celulares. Su acción tóxica es selectiva: las bacterias son más resistentes que los mohos y las levaduras, por la que este gas se emplea frecuentemente como antifúngico.
- El óxido de etileno resulta muy tóxico para los microorganismos y su actividad está relacionada con su acción como agente alquilante. Los mohos y levaduras son más sensibles que las bacterias y estas que las esporas.

sábado, 3 de diciembre de 2011

Curiosidades de la microbiologia

Medios de cultivos



Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado más de 10.000 medios de cultivo diferentes.

Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuadas, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante.

La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares en composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y Peptona a la que se añadirán otros ingredientes.El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo. Se licúa completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mínimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en él.

La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya que bastantes bacterias provocan su licuación.

En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentación de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se añaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes.

También se añaden colorantes que actúan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formación de ácido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH básico y amarillo en pH ácido. La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayoria de las bacterias Gram-positivas).

¿Que son microorganismo?


microorganismos son formas de vida muy pequeñas que sólo pueden ser observados a través del microscopio. En este grupo están incluidas las bacterias, los virus, los mohos y las levaduras. Algunos microorganismos pueden causar el deterioro de los alimentos entre los cuales se encuentran los microorganismos patógenos, que a su vez pueden ocasionar enfermedades debido al consumo de alimentos contaminados. Adicionalmente, existen ciertos microorganismos patógenos que no causan un deterioro visible en el alimento. Sin embargo, por otro lado existen también algunos microorganismos que son beneficiosos y que pueden ser usados en el procesamiento de los alimentos con la finalidad de prolongar su tiempo de vida o de cambiar las propiedades de los mismos (por ejemplo, para la fermentación llevada a cabo para la elaboración de las salchichas, el yogur y los quesos).